分光光度計是用不連續的波長采樣反射物體或透射物體的一種測量儀器。由于不同物體分子的結構不同，對不同波長光線的吸收能力也不同，因此，每種物體都具有特定的吸收光譜。能從含有各種波長的混合光中，將每一種單色光分離出來，并測量其強度的儀器叫做分光光度計。
在使用過程中，由于機械振動、溫度變化、燈絲變形、燈座松動或更換燈泡等原因，經常會出現刻度盤上的讀數與實際通過溶液的波長不符合的現象，因而導致儀器靈明度降低，影響測定結果的精度，需要進行檢驗。
檢驗波長準確度方法是用干涉濾光片或鐠釹濾光片測量儀器的吸收峰值, 如果測出的值與濾光片標準值之差超出規程規定, 則需要進行波長調節。
使用分光光度計的步驟與方法:
預熱儀器：
為使測定穩定，將電源開關打開，使儀器預熱20min，為了防止光電管疲勞，不要連續光照。預熱儀器時和在不測定時應將比色皿暗箱蓋打開，使光路切斷。
選定波長：
根據實驗要求，轉動波長調節器，使指針指示所需要的單色光波長。
固定靈敏度檔：
根據有色溶液對光的吸收情況，為使吸光度讀數為0.2～0.7，選擇合適的靈敏度。為此，旋動靈敏度檔，使其固定于某一檔，在實驗過程中不再變動。一般測量固定在“1”檔。
調節“0”點：
輕輕旋動調“0”電位器，使讀數表頭指針恰好位于透光度為“0”處（此時，比色皿暗箱蓋是打開的，光路被切斷，光電管不受光照）。
調節T=100%：
將盛蒸餾水(或空白溶液或純溶劑)的比色皿放入比色皿座架中的第一格內，有色溶液放在其它格內，把比色皿暗箱蓋子輕輕蓋上，轉動光量調節器，使透光度T=100%，即，表頭指針恰好指在T=100%處。
光具有與其波長成反比的一定量的能量。因此，較短波長的光攜帶更多的能量，而較長波長的光攜帶較少的能量。需要特定量的能量來將物質中的電子提升到更高的能量狀態，我們可以將其檢測為吸收。物質中不同鍵合環境中的電子需要不同的特定能量來將電子提升到更高的能量狀態。這就是為什么在不同物質中對不同波長會發生光吸收的原因。人類能夠看到一系列可見光，從大約380nm（我們看到的紫色）到780nm（我們看到的紅色）。紫外光的波長比可見光短，約為100nm。因此，光可以通過其波長來描述，這在UV-Vis光譜中可用于通過定位與最大吸光度相對應的特定波長來分析或識別不同的物質（參見下文中UV-Vis光譜的應用部分）。
分光光度法是比色法的發展。比色法只限于在可見光區，分光光度法則可以擴展到紫外光區和紅外光區。分光光度法則要求近于真正單色光，其光譜帶寬最大不超過3－5nm，在紫外區可到1nm以下，來自棱鏡或光柵，具有較高的精度。
